G6PDH Assay Kit (Microanalysis)

G6PDH催化NADP⁺还原生成NADPH，在340 nm下测定NADPH增加速率。

100T/96S规格的产品组成及保存条件： 

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研钵和蒸馏水。

二、粗酶液提取：
1.细菌、细胞或组织样品的制备：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：CB0222M-ES体积（mL）为1000~5000：1的比例（建议2000万细菌或细胞加入1mL CB0222M-ES），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2.组织：按照组织质量（g）：CB0222M-ES体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL CB0222M-ES），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3.血清（浆）等液体样品：直接测定。

三、测定步骤：
1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到340 nm。
2.工作液：将CB0222M-B和CB0222UV-C转移至CB0222M-A中充分溶解；在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
3.样本测定（按下表在96孔板中加入如下试剂）

四、G6PDH活力单位的计算：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1.血清(浆)G6PDH活力的计算：
单位的定义：每mL血清(浆)每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
6PGDH (U/mL) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T = 643×ΔA
2.组织、细菌或细胞中G6PDH活力的计算：
(1)按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
G6PDH (U/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T = 643×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
G6PDH (U/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总) ÷T = 643×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
G6PDH (U/10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(2000×V样÷V样总) ÷T = 0.322×ΔA
注：V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L /mol /cm；d：微量石英比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入CB0222M-ES体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000万；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

b. 使用96孔板测定的计算公式如下
1.血清(浆)G6PDH活力的计算：
单位的定义：每mL血清(浆)每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
6PGDH (U/mL) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T = 1286×ΔA
2.组织、细菌或细胞中G6PDH活力的计算：
(1)按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
G6PDH (U/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T = 1286×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
G6PDH (U/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总) ÷T = 1286×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
G6PDH (U/10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(2000×V样÷V样总) ÷T =0.644×ΔA
注：V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入CB0222M-ES体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000万；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

1.实验时，样本在冰上放置，以免变性和失活。
2.比色皿中反应液的温度必须保持 37℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃水浴锅
中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3.最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
4.若样本测定初始值（0s）大于 0.5 而 ΔA测定小于 0.1，可将样本稀释后再行测定。
5.为保证每个样本的反应时间尽量一致不推荐同时测过多样本。
6蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
7.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
8.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。