CYP3A4 活性测定 [2]
1.配制反应液
a. 配制以 Resorufin benzyl ether 为荧光底物的 1 mM 标准原液：取 5 mg Resorufin benzyl ether，溶解于 1 mL 2% w/v Poloxamer 188、500 μL 二甲基亚砜与 3.5 mL 乙腈的混合溶液中。
b. 新鲜配制 CYP3A4 酶液：取 5 mL 1 mM 酶原液，用 995 μL 缓冲液稀释，配制成 5 nM 酶溶液。
2.进行 CYP3A4 活性检测
a. 96 孔板中进行反应：向各孔加入 99 μL 缓冲混合液、1 mL 1 mM Resorufin benzyl ether，将底物终浓度调至 5 mM。
b. 加入 100 μL 5 nM 酶液后，于 37℃条件下孵育 30 分钟。
c. 设定激发波长 (λex=570 nm)、发射波长 (λem=590 nm)，通过荧光检测法测定酶活性。
d. 明确 CYP3A4 活性测定的影响因素，包括缓冲液类型（磷酸盐缓冲液、Tris-HCl 缓冲液）、缓冲液浓度（50-200 mM）、孵育时间（0-50 min）。
CYP3A4 代谢活性测定 [3]
1.向反应体系中加入 CYP3A4 酶，调节其终浓度至 5 pmol / 孔。
2.每孔反应体系中加入 50 pM 底物与 200 mM 磷酸钾缓冲液。
3.与 BzRes 共孵育 45 分钟后，检测代谢物荧光值，设定激发波长 (Ex)=530 nm、发射波长 (Em)=590 nm。
4.将全强度提取物浓度标定为 100%（终检测体系中按 1:4 比例稀释）。
5.对 100% 提取物进行两次 1:3 梯度倍比稀释，计算荧光值的平均值与标准差。