原液制备包括以下步骤：1. 蛋白准备：为了达到最佳标记效果，应将蛋白（抗体）浓度配置为2 mg/mL。1）确保蛋白溶液的pH值控制在8.5±0.5，如果pH值低于8.0，可使用1 M碳酸氢钠进行调整。2）蛋白浓度低于2 mg/mL会显著降低标记效率，建议最终蛋白浓度范围为2-10 mg/mL以达到最佳效果。3）蛋白必须溶解在不含伯胺（如Tris或甘氨酸）和铵离子的缓冲液中，因为这些会影响标记效率。2. 染料准备：将无水DMSO稀释CY染料，配制成10 mM储备溶液，使用玻璃管或旋涡充分混合。注：建议将CY储备液分装后避光保存于-20 ℃或-80 ℃。使用前需用缩合液（500 μg/mL）活化后方可进行标记实验。3. 计算染料工作液用量：所需的CY染料量取决于待标记蛋白的量，CY染料与蛋白的最佳摩尔比约为10。例如：若需标记500 μL 2 mg/mL的IgG（MW=150,000），用100 μL DMSO溶解一管1 mg CY染料，则所需CY体积为3.95 μL，具体计算如下（以CY3-NHS ester为例）：1) mmol (IgG) = mg/mL (IgG) × mL (IgG) / MW (IgG) = 2 mg/mL × 0.5 mL / 150,000 mg/mmol = 6.7×10^-6 mmol；2) mmol (CY3-NHS ester) = mmol (IgG) × 10 = 6.7×10^-6 mmol × 10 = 6.7×10^-5 mmol；3) μL (CY3-NHS ester) = mmol (CY3-NHS ester) × MW (CY3-NHS ester) / mg/μL (CY3-NHS ester) = 6.7×10^-5 mmol × 590.15 mg/mmol / 0.01 mg/μL = 3.95 μL (CY3-NHS ester)。使用方法如下：1. 标记反应：将新鲜配制的10 mg/mL CY染料按计算体积加入到0.5 mL蛋白样品溶液中，轻轻摇匀混合，短暂离心以收集样品到底部，避免剧烈混匀以防蛋白样品变性失活。将反应小管避光放置，在室温下轻轻摇晃孵育60分钟，每隔10–15分钟轻轻颠倒管子几次以充分混合两种反应物，提高标记效率。2. 蛋白纯化脱盐：以下为使用SepHadex G-25柱纯化染料蛋白偶联物的步骤。1）按照说明书准备SepHadex G-25柱。2）将反应混合物装入SepHadex G-25色谱柱顶部。3）当样品运行至顶部树脂表面下方时，立即加入PBS (pH 7.2-7.4)。4）向样品中加入更多PBS (pH 7.2-7.4) 以完成柱纯化，收集含有所需染料-蛋白质缀合物的组分。