一、原液制备步骤

1. 蛋白准备
   1)为实现最佳标记效果，需将蛋白（抗体）浓度调整至 2 mg/mL。
   2)确保蛋白溶液的 pH 在 8.5±0.5 范围内。若 pH 值低于 8.0，可用 1 M 碳酸氢钠调节。
   3)当蛋白浓度低于 2 mg/mL 时，标记效率将显著降低。为优化标记效果，建议蛋白浓度维持在 2-10 mg/mL 之间。
   4)蛋白需溶解在不含伯胺（如 Tris 或甘氨酸）和铵离子的缓冲液中，否则会干扰标记反应。
2. 染料准备
   使用无水 DMSO 配制Cy5.5 染料，浓度为 10 mM 的储备液。通过玻璃棒或涡旋混匀。
   注意：Cy5.5 染料储备液建议分装后避光保存于 -20 ℃ 或 -80 ℃。在后续标记实验前，需用 500 μg/mL 的缩合液（EDC hydrochloride T19947）进行活化。
3. 染料工作液用量计算
   Cy5.5 染料的使用量根据标记蛋白的量决定。Cy5.5 染料与蛋白的最佳摩尔比约为 10。
   示例：需标记 500 μL、2 mg/mL 的 IgG（MW = 150,000）。假设用 100 μL DMSO 溶解 1 mg CY 染料，则计算如下：

1. IgG (mmol) = IgG (mg/mL) ×IgG (mL) / IgG (MW) =2 mg/mL×0.5 mL / 150000 mg/mmol= 6.7×10^6 mmol
2. Cy5.5 (mmol) = IgG (mmol) ×10 =6.7×10^6 mmol×10 = 6.7×10^5 mmol
3. Cy5.5 (μL) = Cy5.5 (mmol)×Cy5.5 (MW)/mg/Cy5.5 (μL) = 6.7×10^5 mmol× 917.06 g/mol / 0.01 mg/μL
   二、标记反应
4. 按计算量取用新鲜配制的 10 mM的 Cy5.5 染料母液（约 10 μL）并加入 50 μL 500 μg/mL 缩合液进行活化。将此混合液缓慢加入 0.5 mL 蛋白样品溶液中，轻轻混匀并短暂离心，使样品沉至反应管底部。避免剧烈摇晃，以免蛋白变性或失活。
5. 将反应管置于避光环境下，在室温条件下轻轻摇晃孵育 60 分钟。每隔 10-15 分钟，轻轻翻转反应管数次，以确保充分混合，提高标记效率。

方法：将 Cy5.5-FFRck-fVIIa 和 Cy5.5 染料单独静脉注射 (i.v.) 到右侧带有表达 TF 的 ASPC-1 和不表达 TF 的 MiaPaCa 胰腺肿瘤异种移植瘤的无胸腺裸鼠 (nu/nu) 中，并测试结合的持续时间和稳定性，以便能够跟踪治疗反应。
结果：从第 1 天到第 26 天，在 ASPC-1和 MiaPaCa肿瘤中均观察到胰腺肿瘤异种移植中的 VEC 中 Cy5.5-FFRck-fVIIa 与 TF 的特定定位，而单独未结合的 Cy5.5 没有观察到特定定位。[1]