反应体系（以50 μL和20 μL为例，推荐冰上配制）

组分	体积（μl）	体积（μl）	终浓度
qPCR SYBR Green Master Mix (High ROX)	25	10	1×
Forward Primer (10μM)	1	0.4	0.2μM
Reverse Primer (10μM)	1	0.4	0.2μM
模板DNA	X	X
无菌超纯水	to 50	to 20
总反应体系	50	20

【注】：使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。
a) 引物浓度：通常引物终浓度为0.2μM，也可以根据情况在0.1-1.0μM之间进行调整。
b) 模板浓度：如模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。
c) 模板稀释：cDNA原液建议5-10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20-30个循环为好。
d) 反应体系：推荐使用20μl或50μl，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
e) 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

####扩增程序（两步法）

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95 °C	5 min	1
变性	95 °C	10 sec	40
退火/延伸	60 °C	30 sec ★	40
溶解曲线阶段	仪器默认设置		1

####扩增程序（三步法）

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95 °C	5 min	1
变性	95 °C	10 sec	40
退火	55-60 °C	20 sec	40
延伸	72 °C	20 sec ★	40
溶解曲线阶段	仪器默认设置		1

【注】高特异性可选择两步法，高效率扩增可选择三步法。
a) 预变性时间：根据不同模板和引物的具体情况可适当缩短至2min。
b) 退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。
c) 荧光信号采集（★）：请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：
30 sec以上：Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus,7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96
31 sec以上：Applied Biosystems: 7300
34 sec以上：Applied Biosystems: 7500
d) 熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。