Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) Assay Kit

DARTS的基本原理是：当小分子化合物与靶蛋白结合后，蛋白的三维结构会发生构象变化，使其对蛋白酶（如胰蛋白酶、热蛋白酶K等）的降解敏感性降低，从而表现出更高的“结构稳定性”。
在未结合化合物的样品中，蛋白质在蛋白酶的作用下容易被水解降解；而在加入药物的小分子处理组中，与药物结合的靶蛋白会被保护不被降解。通过比较两组样品中蛋白残留量的差异，即可初步判断药物与蛋白的结合关系。
DARTS方法的核心优势在于：

• 无需对药物进行任何化学修饰或标记，避免改变药物的理化性质或生物活性；
• 适用于天然复杂体系（如细胞裂解液或组织提取液），能在接近生理环境下反映药物-蛋白相互作用；
• 可与Western blot、SDS-PAGE、银染、考染或质谱分析（LC-MS/MS）联合使用，实现从定性验证到靶点鉴定的完整流程。

100 T规格的产品组成如下：

• 操作简便：提供完整的缓冲液与蛋白酶体系，无需额外优化条件。
• 高灵敏度：能检测纳摩尔级药物-蛋白结合导致的结构稳定性差异。
• 广泛适用：适用于各种来源的细胞裂解液、组织样品或重组蛋白体系。
• 结果直观：通过Western blot或凝胶染色即可直观比较药物处理组与对照组蛋白降解情况。
• 兼容多种后续分析：可结合LC-MS/MS进行全蛋白组筛选分析，发现潜在的新靶点。

小分子药物的靶点筛选与验证、蛋白质与配体相互作用研究、药物作用机制探索。

图1. 药物亲和反应靶蛋白稳定性检测试剂盒用于检测乙酰缬草三酯（Acevaltrate, ACE）对于PCBP1蛋白稳定性的效果图。
HCT116细胞（人结肠癌细胞）裂解后，取5 µL浓度为0、0.125、0.25、0.5、1、2 mM的ACE化合物溶液加入至每组体积为100 µL、蛋白量为100 µg总蛋白中，使最终药物浓度为0、6.25、12.5、25、50、100 µM，室温旋转摇床孵育60 min。然后，加入4 µL稀释好的Protease (0.1 µg/µL) （即Protease:Protein=1:250），混匀，37ºC孵育30 min。接着加入1 µL Protease Inhibitor Cocktail (100×) 终止酶解反应，并加入适量Loading buffer (5×)，100ºC加热10 min使蛋白变性。最后，通过Western blot检测PCBP1蛋白的酶解情况。结果显示，ACE在100 µM下增强了PCBP1蛋白的稳定性，这表明ACE可能与PCBP1蛋白有结合并增强了其对于蛋白酶的耐受性。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
参考文献：Yu D, Hu H, Zhang Q, et al. Acevaltrate as a novel ferroptosis inducer with dual targets of PCBP1/2 and GPX4 in colorectal cancer. Signal Transduct Target Ther. 2025 Jul 7;10(1):211.

1. 细胞收集与裂解：
将HCT116细胞吹散后接种于100 mm培养皿中，培养至细胞密度为85%-90%后，吸除培养基，用PBS洗涤细胞两次后弃掉，再次加入1 mL PBS，用细胞刮刀迅速将细胞从培养皿上刮下（或用胰酶消化收集），转移至1.5 mL离心管中，200 g离心5 min，将PBS弃去。加入适量新鲜配置的含蛋白酶抑制剂以及磷酸酶抑制剂的Lysis Buffer轻轻吹散，置于冰上裂解15 min，12000 rpm、4℃离心15 min。收集离心后的上清液，测定蛋白浓度。推荐使用BCA法或Bradford法进行蛋白定量。根据蛋白浓度测定结果调整蛋白浓度，确保蛋白浓度在1-5 mg/mL。
注：蛋白样品制备完成后，建议立即进行后续实验步骤。若需保存，可将样品分装成适当体积后置于-80°C 保存。长期储存时应尽量避免反复冻融，以防止蛋白降解或活性损失。

2. 酶解比例探索（推荐优先确认酶解比例）：
a)配置Protease储备液：用超纯水配置为10 µg/µL，分装后置于-20℃保存，避免反复冻融，建议在6个月内使用完毕。
b)配置不同比例的酶工作液：取一管母液置于冰上融化，融化后取4 µL加入196 µL超纯水（稀释成50倍，即0.2 µg/µL）。现配现用（最终保证终浓度为Protease浓度为1:125，1:250，1:500，1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000共8个浓度)，具体需根据实验结果调整稀释比例。
下表是以各组样本总蛋白量为100 µg为例，2倍稀释共配置8管酶工作液，最终配置好后A-G每管100 µL，H管200 µL。另外准备1管200 µL不加酶的超纯水作为空白对照。

c)上述9管样品每管混匀后涡旋离心，在37℃恒温下孵育30 min。
d)孵育结束立即加入Protease Inhibitor Cocktail (100×)终止酶解反应。
e)每管加入定量Loading Buffer (5×)（例如100 µL的反应体系加入25 µL的Loading Buffer (5×)），100℃加热10 min终止反应，于-20℃暂时保存样品。
f)进行Western检测PCBP1蛋白的酶解情况。检测结果如下图。

图2. 药物亲和反应靶蛋白稳定性检测试剂盒用于不同Protease与总蛋白比例的检测效果图。
每组100 µL 100 µg的HCT116细胞总蛋白，加入4 µL稀释好的Protease工作液。混匀，37℃孵育30 min进行蛋白消化。孵育结束后加入1 µL Protease Inhibitor Cocktail (100×) 终止反应，并加入Loading buffer (5×)，混匀后100℃加热10 min。随后通过Western blot检测PCBP1蛋白的酶解情况。结果显示Protease和蛋白比例约为1:250时，蛋白条带变化明显，便于后续实验观察小分子药物是否能影响蛋白的稳定性。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

3. 药物处理：
a)根据参考文献或实验设计，设置合适的药物浓度梯度，并由药物母液逐级稀释，制备所需浓度的药物工作液。例如，可设置0、0.125、0.25、0.5、1、2 mM等不同浓度。每次实验应包含两类对照组：阴性对照组（Negative Control）：未加入Protease；空白对照组（Blank Control）：既不加Protease，也不加药物，仅加入药物对应的溶剂（如纯水或DMSO）。推荐每管加入100 µL、1 mg/mL的蛋白样品（即总蛋白量约100 µg），蛋白浓度与体积应与步骤2b保持一致。
b)在各实验管中分别加入5 µL不同浓度的药物工作液。空白对照组中加入等体积的药物溶剂（如纯水或DMSO）。轻轻混匀后，于室温摇床孵育60 min，或在4°C条件下避光孵育过夜。孵育的温度与时间可根据药物性质及参考资料调整。

4. 酶解处理：
a)配置Protease储备液：用超纯水配置为10 µg/µL，分装后置于-20℃保存，避免反复冻融，建议在6个月内使用完毕。
b)制备Protease工作液：根据步骤2中确定的Protease与样品中总蛋白量的比例，从Protease储备液稀释制备所需浓度的Protease工作液。稀释操作应在冰上进行，以保持酶的稳定性和活性。
c) 加酶反应：在各实验组中加入4 µL预先稀释好的Protease工作液；在阴性对照组中加入等体积的超纯水代替Protease。
注：酶解前的蛋白样品应始终保持在冰上或4°C条件下。
d) 酶解孵育：轻轻混匀后短暂离心，使液体集中于管底。将样品置于37°C恒温孵育30 min以进行蛋白酶消化。
e) 终止反应：孵育结束后，立即加入Protease Inhibitor Cocktail (100×) 以终止酶解反应。例如在100 µL反应体系中加入1 µL Protease Inhibitor Cocktail (100×)。

5. 样品处理和保存：
通常可通过多种检测手段评估药物对靶蛋白稳定性的影响：
若研究目的蛋白已知，可利用Western blot分析其在药物处理前后对蛋白酶消化的耐受性变化；
若需探究药物对未知靶标蛋白的作用，则可采用LC-MS/MS鉴定药物结合后蛋白稳定性的变化；
对于具有明确酶活性的靶蛋白，还可结合酶活性检测方法进行高通量筛选；
此外，在靶标蛋白明确的情况下，也可根据实验需求选择 ELISA 等其他检测方式。
以下以Western blot与LC-MS/MS检测为示例：
a)根据样品体积加入相应比例的Loading buffer (5×)，例如在100 µL的反应体系中加入25 µL Loading buffer (5×)。
b)在100°C加热10 min，使蛋白充分变性。
c)加热处理后的样品可直接用于后续分析。若验证药物的已知靶点，可直接进行Western blot检测；若探索未知靶点或新型作用蛋白，可采用LC-MS/MS等蛋白组学分析。如样品暂不使用，应立即置于-80°C保存，以防止蛋白降解或结构变化。

-20℃，1年。

1. 蛋白样品制备后应尽快进行实验，以防蛋白降解或活性丧失。若需保存，请分装后置于-80°C，避免反复冻融。
2. 除孵育及酶解步骤外，其他操作（如样品处理、酶稀释等）应尽量在冰上或4°C条件下进行，以维持蛋白稳定性和酶活性。
3. Protease浓度对实验结果影响较大，过量蛋白酶可能导致非特异性降解，推荐优先进行预实验确认酶解比例。
4. 药物浓度、孵育时间和温度需根据具体药物特性或参考文献进行优化。高浓度药物或长时间孵育可能导致非特异性蛋白变化。
5. Protease 储备液和工作液应避免长时间放置，建议现配现用，使用后立即封盖并置于 -20°C 保存。
6. 加入Protease Inhibitor Cocktail (100×)终止反应后，应立即混匀，防止酶解继续进行。
7. 本品仅适用于专业科研用途，严禁用于临床诊断、治疗、食品或药品领域，且不得存放于住宅等非专业场所。
8. 为保障操作安全与人员健康，操作时请务必穿戴实验服并佩戴一次性手套。

• C0191-药物亲和反应靶蛋白稳定性检测试剂盒说明书-中文 (1.4 MB)