【TargetMol 明星分子】- Z-VAD(OMe)-FMK: 不可逆抑制半胱天冬酶与去泛素化酶，揭示细胞死亡通路关键节点

1. 背景介绍

Z-VAD(OMe)-FMK (T6013)，CAS: 187389-52-2 是一种不可逆、细胞可渗透的广谱半胱天冬酶抑制剂，可与半胱天冬酶活性位点的催化半胱氨酸形成共价加合物，同时还能通过靶向活性位点不可逆修饰并抑制去泛素化酶UCHL1。其肽样骨架（Val-Ala-Asp）匹配酶的底物识别袋，氟甲基酮亲电基团与活性半胱氨酸形成稳定硫醚键，从而将酶固定于失活状态并阻断后续水解循环[2]。在半胱天冬酶信号轴中，外源性死亡受体与内源性线粒体通路分别经起始酶活化，最终级联放大并动员效应酶切割多种底物，诱发PARP裂解、膜起泡、染色质凝聚与DNA断裂等凋亡表型[1]。Z-VAD(OMe)-FMK 通过不可逆占据这些蛋白酶的活性位点，从级联的催化核心处加以拦截，抑制效应酶介导的底物加工，从而压制依赖半胱天冬酶的生物学结局。 UCHL1 在泛素末端剪切与泛素稳态中发挥作用，Z-VAD(OMe)-FMK 对其活性位点的不可逆修饰可影响去泛素化过程与泛素库动态。因此，在利用该化合物界定表型是否源于半胱天冬酶活性时，应结合遗传学手段或正交抑制剂加以区分，以解析半胱天冬酶与去泛素化事件的相对贡献。 在研究中，Z-VAD(OMe)-FMK 适用于：阻断半胱天冬酶依赖的底物裂解以评估蛋白水解在细胞死亡或重塑中的必要性；在保留上游受体或线粒体信号的同时冻结执行阶段，用于绘制通路拓扑与时间顺序；稳定裂解前状态以开展底物谱和生化鉴定；以及借助其对UCHL1的抑制探索蛋白水解与泛素信号的串扰。其不可逆、广谱的特点在多种实验时间尺度上提供稳健的通路抑制，使其成为解析半胱天冬酶参与度的常用化学工具[1,2]。

2. 文献分享

2.1 Amomum tsaoko extract from Nujiang alleviates DSS-induced colitis through inhibiting necroptosis

▲ Z-VAD(OMe)-FMK 作为 necroptosis 诱导体系 TSZ 的组成之一，与 TNF-α 和 SM-164 联用后显著降低 HT-29 细胞活力，而 CG 处理可明显恢复细胞存活。

Z-VAD(OMe)-FMK (T6013)在本研究中被用于HT-29细胞的实验体系，作为抑制半胱天冬酶的组分，并参与构建坏死性凋亡模型。实验步骤为先以20 μM的Z-VAD(OMe)-FMK与10 nM SM-164共同预处理30分钟，随后加入20 ng/mL的人源TNF-α。作者将人TNF-α、SM-164与Z-VAD(OMe)-FMK的组合定义为TSZ，并明确指出TSZ作为坏死性凋亡诱导剂用于在HT-29细胞中建立坏死性凋亡模型。由此，Z-VAD(OMe)-FMK在该研究中的作用体现在其半胱天冬酶抑制属性及其作为TSZ组合的重要组成部分，在上述条件下参与诱导坏死性凋亡的实验流程与模型构建。[3]

2.2 Screening of an FDA-Approved Drug Library: Menadione Induces Multiple Forms of Programmed Cell Death in Colorectal Cancer Cells via MAPK8 Cascades

▲ 通过在HT-29和SW620结直肠癌细胞中给予不同浓度TNF-α联合Z-VAD-FMK（20 µM）处理24小时后以细胞活力检测评估，证实Z-VAD-FMK可影响TNF-α诱导的细胞活力变化。

Z-VAD(OMe)-FMK (T6013) 在结直肠癌细胞死亡模型中被用于研究程序性坏死。文中明确指出，Z-VAD(OMe)-FMK 可在HT-29结直肠癌细胞中引发坏死性凋亡，并且与TNF-α联合时可增强在HT-29细胞中诱导坏死性凋亡的能力。研究首先在HT-29细胞中验证了Z-VAD(OMe)-FMK的作用，结果与先前研究一致，并见于补充图S2A。随后，作者将Z-VAD(OMe)-FMK与Smac mimetics及TNF-α联合应用，构建为TSZ条件（补充图S2B）。在该条件下，向HT-29细胞加入不同浓度的TNF-α，并与Smac mimetics（100 nM）及Z-VAD(OMe)-FMK（20 μM）共同处理，24小时后检测细胞活力；在此设定下，TNF-α诱导细胞死亡的能力随其浓度增加而增强。此外，相同包含Z-VAD(OMe)-FMK（20 μM）的联合条件也用于SW620细胞，并在24小时后评估细胞活力。研究还描述了在HT-29细胞中分别采用TNF-α单独处理或与Smac mimetics及Z-VAD(OMe)-FMK联合处理的实验，并以24小时细胞活力作为读出。综合来看，研究在结直肠癌细胞系的TSZ框架中应用并验证了Z-VAD(OMe)-FMK的相关作用，同时给出了其与Smac mimetics及TNF-α共同使用的具体浓度与实验读出。[4]

3. 结语

Z-VAD(OMe)-FMK 通过不可逆共价结合半胱天冬酶的催化半胱氨酸，有效抑制其蛋白水解活性，阻断细胞凋亡的执行阶段。同时，该化合物亦不可逆修饰去泛素化酶UCHL1的活性位点，影响泛素信号传导。文献中显示，Z-VAD(OMe)-FMK 可用于阻断半胱天冬酶依赖的底物裂解，构建坏死性凋亡模型（如HT-29和SW620结直肠癌细胞中的TSZ体系），并解析蛋白水解与泛素化的相互作用。未来研究可利用该化合物深入探讨半胱天冬酶在多种细胞死亡形式中的作用，优化坏死性凋亡模型，并探索其在癌症及炎症疾病中调控泛素-蛋白酶信号的潜在应用。

4. Q&A

Q1: Z-VAD(OMe)-FMK 的主要作用机制是什么？

A1: Z-VAD(OMe)-FMK 通过其氟甲基酮基团不可逆结合半胱天冬酶的催化半胱氨酸，形成稳定的硫醚键，使半胱天冬酶失活，阻断底物裂解和凋亡执行过程。

Q2: 文献中Z-VAD(OMe)-FMK在坏死性凋亡研究中是如何应用的？

A2: Z-VAD(OMe)-FMK作为TSZ组合（与TNF-α和Smac mimetics）中的半胱天冬酶抑制剂成分，用于在HT-29和SW620结直肠癌细胞中诱导坏死性凋亡模型，帮助研究程序性细胞死亡通路。

Q3: 为什么在使用Z-VAD(OMe)-FMK时需要考虑其对UCHL1的抑制作用？

A3: 因为Z-VAD(OMe)-FMK不可逆抑制去泛素化酶UCHL1，影响泛素剪切及蛋白稳态，可能干扰单纯归因于半胱天冬酶抑制的实验结果，建议结合遗传学或正交抑制剂区分影响。

5. 参考文献

[1] Thornberry NA, Lazebnik Y, et al. Caspases: enemies within. Science. 1998;281(5381):1312-1316.

[2] Garcia-Calvo M, Peterson EP, et al. Inhibition of human caspases by peptide-based and macromolecular inhibitors. J Biol Chem. 1998;273(49):32608-32613.

[3] Wang Y, Lu K, Gong Y, Shao Y, Liu S, Fang Y, et al.. Amomum tsaoko extract from Nujiang alleviates DSS-induced colitis through inhibiting necroptosis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2026;14():.

[4] Cao L, Song W, Sun J, Ge Y, Mu W, Li L. Screening of an FDA-Approved Drug Library: Menadione Induces Multiple Forms of Programmed Cell Death in Colorectal Cancer Cells via MAPK8 Cascades. Pharmaceuticals. 2025;18(8):1145.