【TargetMol 明星分子】- PF-3758309: 靶向PAK4调控细胞骨架与肿瘤生长的强效ATP竞争性抑制剂

1. 背景介绍

▲ PF-3758309 (T6626)，CAS: 898044-15-0

PF-3758309 (T6626)，CAS: 898044-15-0 是一种吡咯并吡唑类小分子，能够以ATP竞争方式高效抑制丝/苏氨酸激酶PAK4（IC50 = 1.3 nM），通过占据激酶活性位点的ATP口袋阻断底物的磷酸转移反应，从而快速关闭PAK4依赖的信号输出。在包含PAK1、PAK3、PAK4、PAK5与PAK6的p21活化激酶（PAK）网络中，PAK4属于II类PAK，位于Rho家族小GTP酶（如Cdc42与Rac）下游，统筹肌动蛋白骨架重塑、黏附动力学、细胞迁移、细胞周期推进以及与凋亡控制相联的存活程序。因此，PF-3758309非常适合在细胞与生化体系中解析PAK通路及其与凋亡信号的耦联关系。 在作用机制层面，PF-3758309对PAK4的抑制会降低一系列经典PAK底物的磷酸化水平，尤其影响调控肌动蛋白组织的LIMK–cofilin轴和黏附复合体的更新节律，从而在表型上引发应力纤维、片状伪足/丝状伪足动力学及细胞牵引力的可测变化。由于PAK信号与增殖和存活相关的效应通路相交汇（并与细胞骨架检查点形成反馈），PF-3758309为直接调控这些关键节点提供了手段，可用于评估PAK4活性如何维持细胞活力并影响凋亡阈值。在PAK活性贡献抗凋亡基调的情境下，急性阻断PAK4可使信号平衡偏向半胱天冬酶级联与线粒体凋亡激活，可通过监测底物磷酸化谱、Annexin V阳性比例、PARP或半胱天冬酶裂解等生化指标加以量化。 在通路解析实验中，PF-3758309有助于在更广泛的PAK家族框架内为PAK4建立因果联系。研究者可将PF-3758309与基因学扰动（如特异性敲低/敲除）联用，以区分PAK4的直接输出与PAK1、PAK3、PAK5或PAK6的代偿信号。结合时间分辨磷酸蛋白组学与细胞实时成像，可解析由PAK4驱动的快速事件；辅以激酶面板与剂量–效应分析，则可界定不同细胞模型中对通路抑制的灵敏度以及突出PAK4依赖表型的浓度窗口。 综上，PF-3758309可作为实用的研究探针，用于：1）界定PAK4在骨架重塑、迁移与黏附可塑性中的功能；2）量化PAK驱动的存活信号对凋亡阈值的贡献；3）通过监测下游底物磷酸化鉴定PAK通路参与的生物标志；以及4）探索与Rho GTP酶和肌动蛋白调控模块的串话。其强效的ATP竞争机制为在生化、细胞与通路重构平台中精确解析PAK4生物学提供了时间与机制双重优势。

2. 文献分享

2.1 Multi-omics analysis reveals RNA polymerase II degradation as a novel mechanism of PF-3758309's anti-tumor activity.

▲ 利用基于 SILAC 的定量蛋白质组学和转录组学研究 PF-3758309 的调控机制。 (A) 基于 SILAC 的定量蛋白质组学和转录组学实验流程示意图，用于全局分析 PF-3758309 在 HCT116 细胞中的潜在靶点。(B) PF-3758309 处理后 HCT116 细胞中蛋白质水平的全局变化（蓝色表示显著下调蛋白，n = 4，fold-change < 1.5 且 p-value < 0.05），标注了 RNA 聚合酶家族成员 POLR2A/B/E。(C) PF-3758309 处理后下调蛋白的 KEGG 通路富集分析，凸显了受这些下调蛋白影响的关键生物学通路。(D) PF-3758309 与 MLN4924 联合处理相较于 PF-3758309 单独处理的蛋白质水平全局变化（红色表示联合处理组中显著上调的蛋白，n = 4，fold-change > 1.5 且 p-value < 0.05）。(E) PF-3758309 单独下调蛋白与 PF-3758309+MLN4924 联合处理（相较于单独处理）上调蛋白的重叠分析。(F) 受 PF-3758309 下调且被 MLN4924 逆转的蛋白的 KEGG 通路富集分析。(G) PF-3758309 处理后 HCT116 细胞中 mRNA 水平的全局变化（n = 3；蓝色点表示显著下调基因，fold-change < 2 且 p-value < 0.05；红色点表示显著上调基因，fold-change > 2 且 p-value < 0.05），标注了 RNA 聚合酶家族成员 POLR2A/B/E。(H) PF-3758309 处理后下调 mRNA 的 KEGG 通路富集分析。

PF-3758309 (T6626) 在多组学层面调控蛋白稳态并作用于RNA聚合酶II亚基。定量蛋白质组显示，PF-3758309 处理导致447个蛋白下调，且下调蛋白富集于RNA聚合酶、细胞周期与AMPK信号通路。与MLN4924联用时，相较于单用PF-3758309 有117个蛋白上调，且83个被PF-3758309 下调的蛋白被MLN4924逆转。Western blot 显示，PF-3758309 在HCT116、HeLa与MDA-MB-231细胞中以时间与浓度依赖方式显著降低POLR2A/B/E水平；蛋白合成阻断实验表明其显著缩短POLR2A/B/E半衰期；TUBE富集实验显示其促进POLR2A/B/E泛素化；且由PF-3758309 诱导的降解可被MLN4924或MG132逆转。蛋白组学进一步表明，在PAK4敲除细胞中PF-3758309 仍可降解POLR2A/B/E。泛素组学结果显示，PF-3758309 全局提升泛素化，显著上升位点达4159个，其中POLR2B/E的泛素化显著增加；与MLN4924联用则较单药降低泛素化水平。结果共同指示，PF-3758309 通过cullin-RING通路促进POLR2A/B/E的泛素化与降解，从而抑制肿瘤生长；多组学整合表明，PF-3758309 促进细胞内依赖泛素化的蛋白降解，并提示其诱导关键蛋白的泛素化与后续降解，最终导致细胞死亡。综上，证据表明PF-3758309 通过调控POLR2A/B/E的依赖泛素化降解来抑制肿瘤生长。[3]

2.2 Simultaneous inhibition of PI3K and PAK in preclinical models of neurofibromatosis type 2-related schwannomatosis.

▲ PI3K/PAK 联合抑制将人 MD-SC 细胞阻滞在细胞周期的 G1 期。 (A) 所有实验批次中活细胞群细胞周期阶段分布图（均值 ± SD）。与 DMSO 对照组相比，PF-3758309 单药（0.15 μM）处理显著增加了 G1 期细胞比例，而 PI3K 抑制剂 Pictilisib（2.5 μM）单药和联合用药组表现出更强的 G1 期阻滞效果，且联合用药组处于 S 期的细胞比例显著低于单药组（**p < 0.01, p < 0.001, ****p < 0.0001）。(B) 代表性流式散点图展示了 0.001% DMSO 溶媒对照和不同药物处理组中 FITC (EdU) 与 FxCycle (DNA 含量) 标记细胞的分布情况。(C) 活细胞成像分析细胞在 EC50 浓度下处理 72 小时的结果，包括细胞汇合度（上图）和归一化至汇合度的荧光 cleaved caspase 3/7+ 信号面积（下图）。结果显示，PF-3758309* 单药或联合用药均未诱导明显的细胞凋亡（caspase 3/7 信号极低），而是主要通过周期阻滞抑制细胞增殖。

PF-3758309 (T6626) 在以缺失merlin的施旺细胞为基础的模型中表现出多项体内外活性。于小鼠坐骨神经原位移植模型中，生物发光成像显示，在整个给药过程中按IVIS信号倍增计算，PF-3758309可降低肿瘤生长速率。对切除肿瘤的免疫组织化学分析提示药效学改变：PF-3758309处理的肿瘤Ki67阳性显著下降，细胞增殖降低，且YAP水平亦显著降低。药代动力学结果显示，口服给药后PF-3758309在2小时达到血浆峰浓度。同时，在肿瘤组织中检测到了PF-3758309，表明其在肿瘤中具有可达性。与pictilisib合用时，PF-3758309的血浆峰浓度提高了三倍，提示合用可增加体内暴露。在人源缺失merlin的施旺细胞实验中，单药PF-3758309处理24小时后，细胞周期分布向G1期转移、S期减少；活细胞成像显示，自给药6小时起与载体对照相比细胞融合度下降。上述结果共同表明，PF-3758309在体内可通过降低Ki67与YAP反映的增殖相关指标并抑制生长信号而发挥作用，能够在肿瘤组织中达到有效暴露，并在体外快速产生抗增殖及G1期富集效应；与pictilisib联用时其血浆暴露进一步增强。[4]

3. 结语

PF-3758309通过竞争性结合PAK4的ATP结合口袋，抑制其底物磷酸化活性，从而高效阻断PAK4介导的信号通路。文献报道显示，PF-3758309能够改变细胞骨架结构，抑制细胞增殖并促进细胞凋亡，尤其通过促进RNA聚合酶II亚基（POLR2A/B/E）的依赖泛素化降解发挥抗肿瘤作用。在以梅林蛋白缺失施旺细胞为模型的体内外实验中，PF-3758309表现出显著的抗肿瘤活性及良好药代动力学特征，且与pictilisib联合用药可增强血浆暴露。未来研究可聚焦于深入解析PF-3758309对PAK4相关信号通路的调控机制，开发联合用药策略以提升抗肿瘤效果，并利用其调控细胞凋亡及骨架重塑的特性推动靶向癌症治疗的应用。

4. Q&A

Q1: PF-3758309抑制PAK4的主要机制是什么？

A1: PF-3758309通过竞争性结合PAK4的ATP结合口袋，阻断底物的磷酸转移反应，快速关闭PAK4依赖的信号输出。

Q2: 文献中PF-3758309对肿瘤细胞有哪些影响？

A2: PF-3758309促进RNA聚合酶II亚基（POLR2A/B/E）的依赖泛素化降解，降低PAK底物的磷酸化，抑制Ki67和YAP等增殖标志物，诱导细胞周期G1期积累，并抑制梅林缺失施旺细胞模型中的肿瘤生长。

Q3: PF-3758309在药代动力学上有哪些表现？

A3: 口服后约2小时达到血浆峰浓度，在肿瘤组织中具有可测得的生物可及性，血浆半衰期短于pictilisib，且与pictilisib联合给药时血浆暴露显著增加。

5. 参考文献

[3] Jia X, Zhang J, Pan L, He J, Zhu M, Zhao L, et al.. Multi-omics analysis reveals RNA polymerase II degradation as a novel mechanism of PF-3758309's anti-tumor activity.. Cell death discovery. 2025;11(1):404.

[4] Nagel A, Huegel J, Petrilli A, Rosario R, Victoria B, Hardin H, et al.. Simultaneous inhibition of PI3K and PAK in preclinical models of neurofibromatosis type 2-related schwannomatosis.. Oncogene. 2024;43(13):921-930.